中国预防兽医学报怎么样?研发如何增快猪的繁殖

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楼主 2020-02-13 14:04:42
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猪繁殖与呼吸综合征CH-1R弱毒株培养工艺优化试验


[摘  要]Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞。本试验通过对PRRSV CH-1R高敏感Marc-145/D2克隆细胞株培养特性的研究,以及分析病毒在不同血清浓度细胞维持液中的增殖水平,筛选出最佳培养条件。结果表明,以Marc-145/D2克隆细胞株无血清培养PRRSV CH-1R的抗原效价可达到108.0 TCID50/mL以上。

[关键词] PRRSV  CH-1R株;Marc-145克隆细胞;无血清培养

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive andrespiratory syndrome,PRRS)是由PRRS 病毒(PRRSV)引起的以母猪流产、死产、木乃伊胎和弱仔,以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病[1]俗称猪蓝耳病。目前猪蓝耳病的防控主要依赖弱毒疫苗免疫。哈尔滨兽医研究所研制的PRRSV CH-1R弱毒疫苗是由经典PRRSV CH-1a强毒株致弱而来,它不仅具有良好的免疫原性[2],其安全性尤为卓越[3],免疫健康猪群无体温升高、采食下降和影响增重现象,是防控猪蓝耳病的有利武器。常规生产工艺培养CH-1R株弱毒时所用牛血清作为疫苗中主要的异源蛋白,很容易引起猪的过敏反应现象。本试验旨在通过克隆对PRRSV CH-1R 弱毒株产毒高敏感性细胞提升单位产量中抗原的效价,同时探索无血清大规模抗原培养工艺,以达到提高疫苗临床使用效果、减少过敏反应发生机率的目的。

1. 材料

1.1 毒种:PRRSV(CH-1R株)种毒,哈尔滨兽医研究所技术转让。

1.2 Marc-145细胞:本公司细胞种子库提供。

1.3 试剂: MEM、胰蛋白酶、新生牛血清均为美国GIBCO公司产品。

1.4 主要设备及仪器:倒置相差显微镜、SAYO二氧化碳培养箱、上海安亭离心机。

1.5 器具:塑料细胞培养方瓶及96孔、24孔、6孔细胞培养板均为美国Corning公司产品、国产10L细胞培养瓶

2. 方法

2.1 Marc-145细胞克隆与计数  

2.1.1 细胞克隆  常规方法复苏1支Marc-145种细胞,待细胞长满单层后,用0.25g/L 胰酶-EDTA消化细胞,大部分细胞圆缩时,加入适量MEM生长液(含新生牛血清 100mL/L)轻轻吹打数次,尽量吹散成单个细胞悬液,计数后按一定比例稀释0.2mL/孔铺于96孔板,置37℃5%CO2培养,次日在显微镜下将含一个细胞的孔挑选出来,在板盖上做标记后继续培养,每天观察一次。选取细胞形态好的克隆集落进行扩繁与冻存[4]

2.1.2 细胞检验  按照《中华人民共和国兽药典》三部(2005版)进行细胞检验 [5]

2.1.3细胞计数  取生长状态良好的Marc-145母细胞与D2克隆细胞株,通过细胞计数精确地将1×105/mL细胞分散悬液接种于T25方瓶内,两株细胞各分装3瓶,每瓶细胞均加入8mL含8%新生牛血清的MEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞培养至72h时按常规方法消化,并进行活细胞计数,试验重复三次。

2.2 细胞生长性能与培养条件的筛选

2.2.1 克隆细胞株生长曲线 取生长状态良好的Marc-145/D2克隆细胞株与母细胞,消化制成细胞悬液,通过细胞计数精确地将4×104/mL细胞分散悬液接种于T25方瓶内,两株细胞各分装24瓶,每瓶细胞均加入8mL含8%新生牛血清的MEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,每天观察细胞生长情况,并分别于1~8d每天各取其中3瓶细胞进行染色、计数,取平均值绘制细胞生长曲线。培养第4d时尚未计数的细胞需换液一次。[4]

2.2.2最佳细胞接种数试验   细胞悬液浓度从低到高依次为:5×104/mL、1.0×105/mL、1.5×105/mL、2.0×lO5个/mL分别接种于T25细胞方瓶中,每个稀释度各2瓶,每瓶装量8mL,置于 37℃ 5%CO2培养箱中,每间隔24h观察细胞一次,观察至72h,根据细胞长成致密单层的时间与细胞计数情况确定最佳的细胞接种数。

2.2.3  Marc145细胞在不同浓度血清培养液中的生长情况   将试验细胞分成3组,将MEM细胞培养液中的血清含量分别调整为6%、8%、10%(体积分数φ),选取Marc-145/D2细胞株,按1.0×105/mL细胞密度分别接种8mL细胞悬液至T25细胞培养瓶,每组3瓶,置于37℃ 5%CO2 培养箱中,培养72h将3组细胞消化后按常规方法进行细胞计数,根据公式计算增长率,以确定最佳的血清浓度。

2.3 细胞产毒试验

2.3.1 母细胞与克隆细胞产毒对比  将Marc-145母细胞与克隆细胞D2株分别以3个相同代次的单层细胞方瓶进行产毒试验。二组细胞均选取3个已形成致密单层的T1875px2方瓶,弃去生长液,换上含2%血清pH7.2的维持液25mL/瓶,接种PRRSV CH-1R株 使每毫升维持液中病毒含量为105.5TCID50,每组另设1瓶细胞仅换上维持液作为阴性对照,置37℃5% CO培养箱中培养,24h后每隔4h观察1次,待细胞病变(CPE)达80%时每组3瓶病毒液混合收获后取样,置于-20℃冻融2次,测定半数细胞感染剂量(TCID50[6]

2.3.2 不同血清浓度产毒对比 选取Marc-145/D2株已长成致密单层的10L转瓶细胞分为4组作为试验细胞,每组3瓶,弃去细胞生长液后换上含0%、1%、2%、4% 新生牛血清pH7.2的维持液1L/瓶,然后在维持液中接种PRRSV CH-1R株105.5TCID50/ mL,同时设3瓶细胞换上2%血清维持液不接毒作为阴性对照,置 37℃ 温室中转瓶培养,24h后观察 CPE,待 CPE 达80%以上,将每组病毒液混合后收获留样,置于-20℃冻融 2次,测定TCID50,试验重复三次。

3. 结果

3.1 Marc-145细胞克隆与计数  

3.1.1 细胞克隆结果  母细胞经过克隆优化获得D2细胞株为典型的上皮细胞,个体较小排列整齐,细胞折光性好、界限清晰,细胞质中颗粒较少,同等条件下培养72h,其生长速度比母细胞快而且更为致密。见图1、2(×100倍)。                        

3.1.2 细胞检验结果  D2细胞株按照《中华人民共和国兽药典》三部(2005版)进行细胞检验,各项检验结果均合格。

3.1.3细胞计数结果 见表1。

3.2 细胞生长性能与培养条件的筛选

3.2.1克隆细胞株生长曲线

3.2.1.1克隆细胞1~8d计数结果 见表2。

3.2.1.2细胞生长曲线 见图1。

3.2.2最佳细胞接种数试验结果   当方瓶培养细胞接种数为5×104个/mL时生长速度比较缓慢,72h仍不能形成致密单层;细胞接种数为2.0×105个/mL时细胞贴壁后容易聚集成团,培养48h时部分细胞界限模糊,开始出现老化现象。试验观察结果表明,48h形成单层细胞最佳接种量为1.5×105个/mL,72h形成单层最佳接种量为1.0×105个/mL。

3.2.3 Marc145/D2株细胞培养液适宜血清浓度选择  在6%血清浓度下细胞形态正常,但生长速度较慢,72h还未形成致密单层;血清含量为8%、10% 二组细胞生长旺盛,界限清晰排列整齐,呈典型上皮样形态,培养48h二组细胞形态基本没有明显差异,但10%血清细胞在72h细胞质中黑点状颗粒物增多,细胞间界线开始模糊,出现细胞老化现象。结果表明8%血清含量是配制Marc-145/D2株细胞生长液较为适宜的浓度。细胞计数结果与细胞增长率 见表3。

3.3 细胞产毒试验

3.3.1 母细胞与克隆细胞产毒结果(见表4),试验数据对比表明,D2克隆株制备病毒液的效价与母细胞相比提高100.375TCID50/mL以上。

注:测毒所用细胞为克隆前Marc-145母细胞

3.3.2 不同血清浓度维持液细胞产毒对比 维持液血清含量在2%时,转瓶培养比方瓶静止培养细胞产毒提高100.3TCID50/mL以上。随着血清浓度增高,转瓶细胞产毒TCID50略有增长。详见表5。

注:测毒所用细胞为克隆前Marc-145母细胞

4. 讨论

  1)克隆分离出的Marc-145/D2株细胞呈典型上皮细胞的形态特征,折光性好、界限清晰、排列整齐,且增殖速度更快。培养72h活细胞计数结果,D2株单位面积的细胞数比母细胞增加15%以上,为病毒的增殖提供了良好的基础。

  2)从细胞生长试验结果可以看出,生长液血清含量为8%时较为合适,在8%血清营养液同等培养条件下,48h形成单层细胞最佳接种量为1.5×105个/mL、72h形成单层最佳接种量为1.0×105个/mL。当营养液中血清浓度过高时,虽能加快细胞分化速度,但细胞形成单层后形态较差,个体大小不整齐,且细胞质内颗粒状黑点增多,细胞间界线模糊呈现老化现象。

  3)克隆细胞产毒对比试验表明,同等接毒剂量下Marc-145/D2株病变细胞整体圆缩,病变程度均匀,其速度也较母细胞株更快,这样能够达到同期收获,病毒在维持液效价衰减更小,D2株平均产毒较母细胞高出100.4TCID50/mL以上,具备作为PRRSV CH-1R株高敏感性细胞株的潜力。

  4)通过Marc-145/D2株在不同血清浓度维持液中细胞产毒对比试验,探索了CH-1R弱毒株无血清培养工艺。从三次转瓶试验的结果分析,随着血清浓度增高,转瓶细胞产毒TCID50仅略有增长,2%血清组与无血清组差异不明显,当血清浓度上升至4%时,其产毒效价仅比无血清组提高100.3TCID50/mL。试验结果表明,采用维持液无血清培养工艺产毒可高达108.0 TCID50/mL以上。无血清培养不仅可以节约生产成本,更为重要的是能减少成品中异源蛋白含量,降低疫苗使用过程中仔猪过敏反应等免疫应激发生的概率。

参考文献

[1] WenswoortG. Porcine reproductory and respiratory syndrome[J]. Proc , 13 th Int Pig VetSoc Congr , 1994.11~14.

[2]  胡守萍,张卓,蔡雪辉,等. 猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和变异株灭活疫苗的免疫效果评价[J].中国预防兽医学报,2009,31(5):392~396.

[3]  王洪峰,蔡雪辉,刘永刚,等. 猪繁殖—呼吸综合征活疫苗对仔猪的安全性试验[J].中国预防兽医学报,2006,28(3):341~343,346.

[4]  司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司,2007.

[5]  中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二O O五年版[S].北京:中国农业出版社,2006.

[6]  中华人民共和国农业部.兽用生物制品质量标准汇编[S].2006-2008.



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